【www.zhangdahai.com--学生演讲稿】
摘 要目的：观察桑银降糖胶囊对糖尿病模型大鼠胰腺细胞凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的影响。方法：免疫组化SP 法检测bcl-2 蛋白和bax 蛋白的表达.结果：在应用桑银降糖胶囊后,bcl－2 表达显著回升而bax 表达显著回降, 表明桑银降糖胶囊 能通过调节bcl－2 和bax 的表达恢复bcl－2 与bax 间的正常比例, 而维护胰腺的自稳状态。结论：桑银降糖胶囊能通过上调bcl－2 同时下调bax, 而抑制胰岛细胞凋亡, 从而维护糖尿病模型大鼠的胰岛功能。
关键词糖尿病；胰腺；细胞；bcl－2；bax；表达
AbstractObjective：To observe the effect of Sangyin capsule, which is the Apoptosis and expression of apoptosis-related genes of islet cells of streptozocin(STZ) -induced diabetic rats. Methods: Forty STZ- induced diabetic rats were randomly divided into four groups: model group, positive control group with insulin-administration, high dose of Sangyin capsule- administration group, low dose of Sangyin capsule -administration group. 28 days later the blood glucose concentration was determined using one-touch basic Glu meter. To useimmunohisto- chemistrySP method detected their express the proteinum both Bcl-2 and Bax.result：Afert application Sangyin capsule- administration,Bcl－2 expression was advanced andBax expression was subdued predominance. The normal proportion ofboth Bcl-2 and Bax can be recovered to regulat the expression both Bcl-2 and Bax by Sangyin capsule and serviced immunological homeostasis ofinsular. Conclusion: Sangyin capsule can up-regulate Bcl-2 and dowe regulate Bax at the same time, and inhibit the apoptpsis of insular cells , whith protected the function on glandular cells of streptozocin(STZ) -induced diabetic rats.
Key Wordsdiabetes；pancreas；cell；Bcl-2；Bax；expression
糖尿病是严重危害人类健康的常见病和多发病，全球糖尿病的平均患病率目前大约为5.7%或更多，现今共有超过2.3亿的糖尿病患者,并且正以每年新增700万人的速度递增，成为仅次于心血管疾病的危险因素。然而对于糖尿病的治疗，目前还没有根治措施。虽然西药有明确的改善症状、防治并发症的作用，但由于西药的副作用及治疗失效等难以克服的缺点,从中药等天然药物中寻找有效的抗糖尿病药物或成分遂成了近年糖尿病治疗的研究热点。国内外大量研究表明治疗糖尿病有效的中药很多[1] [2],包括桑叶、银杏叶、大黄、黄连、当归等等。我们通过辨证后，运用桑叶多糖、银杏黄酮、牛磺酸、生物铬等中药有效成分按一定比例配伍，组成桑银降糖胶囊，并对链脲酶素所致SD大鼠糖尿病模型进行治疗，通过观察胰岛β细胞凋亡密切相关的凋亡抑制基因bcl-2和促凋亡基因bax基因的表达变化,探讨桑银降糖胶囊在糖尿病治疗机制中的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
正常SD大鼠50只，雌雄各半，体重180g～200g（购自中国人民***军事医学科学院动物实验中心，许可证号：SCXＫ－（军）2002－001）。
1.1.2动物分组
共分为5组： 正常对照组，阴性对照组，桑银降糖胶囊大剂量组，桑银降糖胶囊小剂量组，桑枝颗粒对照组。
1.1.3饲料
全价颗粒营养饲料，由山东大学实验动物中心提供。
1.1.4实验环境
①温度：20～260C；②相对湿度：40～60%。自然光照，每天上、下午各通风半小时。每日更换消毒垫料、清洁笼具、饮水瓶。
1.1.5药物
①桑银降糖胶囊0.3g /粒，72粒/瓶，本研究室提供。②桑枝颗粒，青岛海尔药业有限公司，批号：Z19990035。
1.1.6试剂
链脲霉素（STZ）：美国Sigma公司产品。
1.1.7免疫组化试剂盒
免疫组织化学法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达Bcl-2和Bax兔抗鼠多克隆抗体均为Santa-Cruz公司产品,采用SP二步法免疫组化试剂盒,均购自北京中衫生物有限公司。
1.2方法
1.2.1动物模型的制备
取SD大鼠40只，实验前适应饲养一周，并随机分组，每组10只，一组为正常对照组，其余大鼠禁食12小时后，按 60mg/kg的剂量尾静脉注射STZ, 48小时后测空腹血糖，若低于16.67mmol/L,适量补加STZ一次，测空腹血糖持续高于16.67mmol/L并稳定一周为糖尿病(DM)造模成功。
1.2.2桑银降糖胶囊治疗
正常对照组：正常SD大鼠10只，每天灌喂生理盐水1ml。阴性对照组：糖尿病动物模型SD大鼠10只，每天注射胰岛素2u。试药大剂量组：糖尿病动物模型SD大鼠10只，每天灌喂桑银降糖试剂0.4克/1ml。试药小剂量组：糖尿病动物模型SD大鼠10只，每天灌喂桑银降糖试剂0.2克/1ml。桑枝颗粒对照组：糖尿病动物模型SD大鼠10只，每天灌喂桑枝颗粒0.4克/1ml，各组均给药30天。
1.2.3血糖测定
微量血糖测定法。于实验前后各组测空腹血糖浓度，用微量血糖测定仪测定。德国Bayer Co.治疗前后尾部取血测定血糖浓度。
1.2.4胰岛素测定
放免试剂盒，北京北方生物技术研究所。批号：070420。操作按说明进行。
1.2.5C肽测定
C肽放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所。批号：070420。操作按说明进行。
1.2.6组织标本制备
取大鼠胰腺切成3mm薄片后用10%中性福尔马林固定,常规脱水石蜡包埋,制作切片,切片厚5μm,HE染色,光镜观察。
1.2.7 HE染色方法
石蜡切片厚度为5μm,裱于干净载玻片上,60℃考片机上考片2h→二甲苯脱蜡2次,每次15min→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水苏木素染胞核5～10min→10%盐酸酒精分化→自来水冲15min(反蓝)→蒸馏水→伊红染胞浆→各级酒精脱水→二甲苯透明→树脂胶封片→显微镜观察。
1.2.8免疫组化染色步骤
切片经脱腊至水,3 mL/LH2O2室温孵育5～10 min,高压修复2～5 min,一抗1∶100稀释,4℃过夜,生物素化羊抗兔IgG(二抗)37℃孵育20～30 min, DAB室温显色3～10 min(显微镜下控制显色程度)。各步骤间用0.01 mol/L PBS(pH7.2)充分洗涤3 min×3次。苏木素复染,常规脱水、透明、封片。对照试验用PBS代替一抗。阳性细胞计数:Bcl-2和Bax阳性物质位于胞浆,在10×40倍光学显微镜下观察。
1.2.9 统计学处理
所有数据均用X ±S表示，数据统计由SPSS12软件处理，组间比较用t检验。
2结果
2.1桑银降糖胶囊对糖尿病动物模型SD大鼠降糖作用的影响
桑银降糖胶囊大剂量组血糖浓度6.33±1.66 mmol/L与阴性对照组20.64±11.10mmol/L相比差异具有显著性P
参考文献
[1] W.L. Li,H.C.Zheng, J.Bukuru,et al. Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 92:1-21.
[2]赵骏,高岚.桑叶多糖的降糖降脂作用.天津中医药.2004,21: 505-506.
[3] Lupi R, Dotta F, Marsella L,et al.Prolonged exposure to freefatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on humanpancreatic islets: evidence that beta-cell death is caspase me-diated , partially dependent on ceramide pathway and Bcl-2redulated. Diabetes,2002,51:1437-1442.
[4] Piro S, Anello M, Di Pietro C,et al.Chronic exposure to freefatty acids or high glucose induces apoptosis in rat pancreaticislets: possible role of oxidative stress.Metabolism, 2002, 51:1340-1347.
[5]NandhiniAT，ThirunavukkarasuV，AnuradhaCV．Stimulation ofGlucoseUtilization and inhibition of protein glycation andAGE productsby taurine[J]．Acta PhysiolScnad，2004，181(3)：297-303．
[6] 余华荣、张能、董毅龙等，牛磺酸对STZ诱导大鼠胰岛细胞凋亡及BCL－xL和BAX表达变化的影响。基础医学与临床2006；26（6）：613～616.
[7] Cheng EH,Kirsch DG, Clen RJ,et al・Conversion of Bcl-2 to a Baxlikedeath effector by caspases〔J〕・Science, 1997; 278: 1966-8.
[8] Reed JC・Bcl-2 and the regulation of programmed cell death〔J〕・J Cell Bio,l 1994; 124: 1-6・
[9] Heermeier K, Benedict M, Li M,et al.Bax and Bcl-xS areinduced at the onset of apoptosis in involuting mammary ep-ithelial cells. Mech Dev,1996,56:197-207
[10] 宋福印，栗德林，周景华等，消渴停对胰岛B细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Fas蛋白表达的影响. 中国中医药信息杂志2001；8（6）：24～26.
[11]Federici M, Hribal M, Perego L,et al.High glucose causesapoptosis in cultured human pancreatic islets of Langerhans: apotential role for regulation of specific Bcl family genes towardan apoptotic cell death program.Diabetes,2001,50(6):1290-1301.
[12] Thomas D, Yang H, Boffa DJ,et al.Proapoptotic bax is hyperexpressed in isolated human islets compared with antiapoptotic Bcl-2. Transplantation,2002,74:1489-1496.
*本课题由山东省科技厅资助，科技攻关项目，编号（2005GG3202043）。
作者简介：
唐天华研究员 ，山东省医学科学院基础医学研究所。
