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摘要目的：建立肤痔清软膏微生物限度检查方法。方法：以3株细菌、2株真菌对肤痔清软膏进行微生物限度检查方法的验证试验。结果：试验组枯草芽孢杆菌、白色念珠菌采用培养基稀释法回收率为88％以上：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉采用常规法回收率为85％以上；控制菌检查试验组采用100ml增菌培养基，可检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌；采用200ml疱肉培养基可检出生孢梭菌。结论：经验证肤痔清软膏微生物限度检查采用培养基稀释法检查梭菌、细菌、霉菌和酵母菌；常规法检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。
关键词 茁药肤痔清 微生物限度检查方法
肤痔清软膏是由黄柏、土大黄、金果榄等组成的复方制剂，苗医：旭嘎凯沓痂，样丢象泱安，滁内挡祛卡。陡：嘎久杠工浆店羌，罗欧，岗俺，阴高坳。中医：具有清热解毒，化瘀消肿，除湿止痒功能，常用于湿热蕴结所致手足癣、体癣、痔疮肿痛出血、带下病等在微生物限度常规检验中，微生物的检出率都较低。为保证检验方法的科学性、可行性及结果的准确性，本试验用2005年版《中国药典》规定的3株细菌、2株真菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌)对3批肤痔清软膏进行了微生物限度检查法的验证试验研究，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定和控制菌检验及检查药品本身污染微生物的状况。
1 材料
1．1 仪器YJA-电动匀浆仪(台州市椒江五星试压设备有限公司)，SE2020电子天平(梅特勒－托利多常州衡器有限公司)，二氧化碳培养箱(美国SHEL・LAB)。
1．2 培养基营养琼脂培养基(批号031142)、营养肉汤培养基(批号50121)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号040202)、BL培养基(批号050321)、pH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液(批号060223)，北京三药科技开发公司；氯化钠(批号041011)，成都五环高欣化学试剂厂；疱肉牛肉粒(批号060314)，北京陆桥技术有限责任公司。
1．3 供试品肤痔清软膏(批号为20060302 2006040520060601)。
1．4 菌种大肠埃希菌[CM-cc(B)44102]、枯草芽孢杆菌[cMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]均由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法与结果
2．1 菌液制备将上述5株菌的新鲜培养物分别接种至规定培养基，细菌培养16h；酵母菌培养24h；霉菌培养5d，按《中国药典》2005年版二部附录方法制备菌(孢子)悬液，备用。
2．2 供试液制备按规定取供试品10g，按《中国药典》2005年版一部附录方法制成1:10供试液，备用。
2．3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
2．3．1 试验组供试液1ml和50～100CFU试验菌，分别注入平皿中，每株菌平行制备2个平皿。
2．3．2 菌液组测定所加的试验菌数。
2．3．3 供试品对照组取试验组供试液注皿量，测定供试品本底菌数。
2．3．4 回收率计算回收率％=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100％
2．3．5 结果判断 在3次平行试验中，试验组的菌回收率均应在70％以上；若低于70％，应采用适宜的方法消除供试品的抑菌活性，重新进行验证试验。
预试验 取供试液1，0.50，0.33，0.2ml分别注1皿为一组，每组加入1种试验菌菌液，共5组。枯草芽孢杆菌1，0.50．0.33ml・皿-1的回收率分别为45.8％，67.6％，84.5％，黑曲霉1，0.50ml・皿-1的回收率分别为69，83.6％，白色念珠菌0.2・皿-1的回收率为96.2％，其余2株菌1ml・皿-1的回收率均达80％以上。
根据预试验结果，白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉分别采用培养基稀释法0.2ml・皿-1(1 ml分注5皿)、0.33ml・皿-1(1 ml分注3皿)、0.5ml・皿-1(1 ml分注2皿)其余2株菌采用常规法1ml・皿-1进行验证试验。
结果见表(表试验组数据除白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉为10皿、6皿、4皿平均值外，其余2株菌及菌液组均为2皿平均值)。
2．4 控制菌检查方法的验证
2．4．1 试验组供试液10ml及10～100CFU铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌加入相应培养基中，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法检查。
2．4．2 阴性菌对照组 方法同试验组，以大肠埃希菌作为阴性对照菌。
2．4．3 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌；试验组应检出试验菌，该试验方法成立。
试验结果见表。
2．4．4 采用经验证的方法检查3批肤痔清软膏20060302、20060405、20060601细菌数分别为10，20，小于10个g-1，霉菌及酵母菌数均小于10个g-1，未检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌。3讨论
(1)肤痔清软膏对白色念珠菌有较强的抑制生长速度作用，当供试液为1，0.5，0.33．0.25ml・皿-1时，加入的白色念球菌，培养72h菌落细小且与平皿内沉淀物不能区别，培养时间延长至96h，该菌并不随培养时间延长而菌落增大，需室温放置24h后菌落方清晰可见。1，0.5，0.33，0.25ml・皿-1白色念珠菌的回收率分别为12％，84％，84％，96.2％，虽然从0.5m/・皿-1回收率即可达70％以上，但方法的可行性差，不宜用于该供试品的霉菌、酵母菌检查。供试液量降低至0.2ml・皿-1时，培养72h菌落清晰可辨，基本消除肤痔清软膏对白色念珠菌的抑制生长速度作用。
(2)生孢梭菌菌种保存时间不宜过长，新开启的生孢梭菌冻干菌种有利于梭菌检查方法验证。本试验采用保存数月菌种的新鲜培养物，接种50～100CFU至试验组疱肉培养基中，经培养浑浊、产气、臭气、消化碎肉现象明显，显微观察典型次末端位芽孢生长良好，但将该培养物0.2ml接种至庆大霉素哥伦比亚琼脂培养基，按规定培养后，平皿表面无明显菌落生长，将培养物接种量增至0.5ml仍无明显菌落生长。采用庆大霉素哥伦比亚血琼脂，平皿表面可见细小、雾状菌落，革兰染色可见典型芽孢菌，但该培养基中的血干扰过氧化氢酶实验呈阳性反应。采用新开启的生孢梭菌冻干菌种重新进行试验，疱肉培养物在庆大霉素哥伦比亚琼脂培养基上生长良好，过氧化氢酶实验呈阴性反应。
(3)经验证：生产企业在原、辅料、生产和检验等条件不变的情况下，肤痔清软膏的微生物限度检查可按以下方法进行检验。供试液1ml分注3皿，每皿0.33ml，测定细菌数；供试液1ml分注5皿，每皿0.2ml计霉菌及酵母菌数。分别取供试液10ml加入100mlBL培养基、营养肉汤培养基、200ml疱肉培养基，按2005年版《中国药典》微生物限度检查法铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法检查控制菌。
